知 识 百科

凝胶电泳

+1

什么是凝胶电泳
凝胶电泳(英语:Gel electrophoresis),被科学工作者(如大小、形状、等电点等)的分子。凝胶电泳通常用于分析用途,但也可以作为制备技术,在采用某些方法(如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹)检测之前部分提纯分子。可、 脉冲电场凝胶电泳。

更多什么是凝胶电泳>>

从锋菲恋中探讨孩子需要怎样的爱婴儿辅食应选无糖

凝胶电泳的基本原理
凝胶电泳的原理比较简单。当一种分子被放置 在电 场当 中时 , 它们 就会 以一定 的速 度移向适当的电极 , 这种电泳分子在电场作用下的迁移速度 , 叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说 ,电场强度越大、电泳分子所携带的净电荷数量越多 ,其迁移的速度也就越快 , 反之则较慢。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质 , 如琼脂糖凝胶和聚丙 烯酰胺 胶等 , 从而降低了对流运动 , 故 电泳 的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩 擦系数 是分 子的大 小、极性及介质 粘度 的函数 , 因此根据分子大小的不同、 构成或形状的差异 , 以及所带的净电荷的多少 , 便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。在生理条件下 ,核酸分子的糖- 磷 酸骨架中的磷酸基 因 呈离子状态 ,从这种意义上讲 ,D N A 和 R N A 多核苷酸链可叫做 多聚 阴离 子 ( P ol yani o n s ) 。因 此 , 当核 酸分 子 被放 置在 电场中时 , 它们就会向正电极的 方向迁 移。由 于糖- 磷酸 骨架 结构 上的重 复性 质 , 相同 数量 的双链 D N A 几乎具有等量的净电荷 , 因而 它们 能以 同样 的速 度向 正电 极 方向 迁移。 在一 定的电场强度下 , D N A 分子的这种迁移速度 , 亦即电泳的迁移率 , 取决于核酸分子本身的大 小和构型 , 分子量较小的 D N A 分子比分子量较大的 D N A 分子迁移要快些。这就是应用凝胶电泳技术分离 D N A 片段的基本原理。

更多凝胶电泳的基本原理>>

避孕的原理是什么食肉减肥的原理

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳
琼脂糖 ( Agarose ) 是一种线性多糖聚合物 , 系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的 电泳介 质 , 其密 度是由 琼脂 糖的浓 度决 定的。经过化学修饰的低熔点 (LMP) 的琼脂糖 , 在结构上比较脆弱 , 因此在较低的温度下便会熔化 , 可用于DNA片段的制备电泳。

聚丙烯酰胺凝胶主要有两种方式 : 一是用于分离和纯化双链 D N A 片段的非变性聚丙烯酰胺凝胶。在未变凝胶中分离 D N A 的缺 点是 D N A 的 迁移 率受碱 基组 成和序 列的 影响。由于无法得知未知 D N A 的迁移是 否反 常 , 故不能用未变性的聚丙烯酰胺凝胶 电泳 确定双链 D N A 的大小。二是用于分离及纯化 单链 D N A 片 段的 变性聚 丙烯 酰胺凝 胶。这 类聚丙烯酰胺凝胶是在核苷酸碱基配对抑制剂 ( 尿素或甲酰胺 ) 的存在下聚合而成 , 变性DNA的移动速度同其碱基组成及序列几乎完全无关 , 故可用于分离及纯化单链DNA片段和DNA测序等。

更多琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳>>

牙结石是怎样形成的居家减肥10妙招 轻松享瘦

脉冲电场凝胶电泳
普通的凝胶电泳技术显然是无法分离如此超大分子量的DNA分子的。

1984 年 , D . C . Sch wa r t z 和 C . R . Cantor 发 明 的 脉 冲 电 场 凝 胶 电 泳 ( PulsedFie l d Ge l E l ec trophoresis , PFGE ) 技术 , 可以成功地用来分离整条染色体这样的超大分子量的 DNA分子。 在常 规的琼 脂 糖凝胶电泳中 , 超 过一 定 大小范围的所有的双链DNA分子 ,都是按相同的速率迁移的。这是因为它们在单向恒定电场的作用下 ,仅以 “ 一 端 向 前” 的方式游动穿过整个胶板。而在脉冲电场中 , DNA分子的迁移方向是随着所用的电场方向的周期性变化而不断改变的。

在 标 准 的P F GE 中 , 头一个脉冲的电场方向与核酸移 动方向 成 4 5 ° 夹角 , 而 下一个 脉冲 的电场 方向 与核酸移动方向在另一侧亦成 45 ° 夹 角。由 于加 压在 琼脂 糖凝 胶 上的 电场 方向、 电流 大小 及作用时间都在交替地变换着 , 这就使得 D N A 分子能够随时 地调整 其游动方 向 , 以适应凝 胶孔隙的无规则变化。与分子量较小的 D N A 分子相比 , 分子量较大的 D N A 分子需要更多 的次数来更换其构型和方位 , 以使其可以按新的方向游动。因此 , 在琼脂糖介质中的迁移速率也就显得更慢一些 , 从而达到分 离超 大分子 量 D N A 分 子的 目的。 应用 脉冲 电 场凝 胶电 泳技术 , 可成功地分离到分子量高达107bp的DNA大分子。

更多脉冲电场凝胶电泳>>

为什么早产儿长大后可能更怕疼?几篇有关节奏训练的文章(上)

凝胶电泳的应用
凝胶电泳被广泛用于分子生物学、遗传学和生物化学:

⒈大的DNA或者RNA分子通常利用琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis)分离,也可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。

蛋白质的凝胶电泳通常在加入十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶中进行(SDS-PAGE),或者非变性凝胶电泳,或二维电泳。

3.毛细管电泳

⒋酶谱法(zymography)

⒌变性梯度胶凝电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

更多凝胶电泳的应用>>

保养品如何有效应用小儿药物应用有什么特点

凝胶电泳的决定因素
琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:

DNA的分子大小

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比,分子越大则所受阻力越大,也越难于在凝胶孔隙中蠕行,因而迁移得越慢。

琼脂糖浓度

一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

DNA分子的构象

DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而开环双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。

电源电压

在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段有效分离所加电压不得超过5V/cm。

嵌入染料的存在

荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15%。

离子强度影响

电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。

更多凝胶电泳的决定因素>>

决定宝宝身高的重要因素!顺产由哪些因素决定?


相关专家达人解答
向专家提问,十分钟有问必答

提示:如果您没找到满意的内容,请到育儿问答向专家提问吧。

育儿热词
还有更多凝胶电泳的问题?

词条信息

词条分类:健康百科

词条时期: